点击数：30552013-03-12 14:19:14 来源: 彭渊
这是08级研究生彭渊提前进入课题组实验的工作心得，其时她尚未报到入学，新手上路，体会值得借鉴。
病理制片学习心得
彭渊
进实验室学习两月余，学习了一些基本的实验技术。在病理制片方面，承蒙师兄师姐的耐心教导，使我初步掌握了整个制做流程。新手上路，在学习的过程中，犯过许许多多的错误。小小的一张病理切片，看似普通，但其中蕴含了很多"门道"。整个制做过程都是一环套一环的，任何一个环节出了差错，最终都会影响到整张切片的质量。通过一段时间的学习，有点体会，现汇报如下：
一、工欲善其事，必先利其器！
每次在制做切片之前，都应该事先准备好必要的器械和材料。刚开始学习制片的时候，每次到了病理室都会发现有东西落下没拿，再回实验室拿很浪费时间。有过几次“丢三落四”的经历之后，写了份清单，把每个步骤所需要的实验器械列了张表，这样就少走了好几次“冤枉路”了。
二、取材
取材是制片的首要步骤，取材不当，会直接影响整张切片的质量，更会影响病理诊断的结果。因此，组织标本的取材非常重要，不能随意切取组织来制作组织切片。切取组织不宜过大，过大过厚的组织在放入包埋框脱水的时候，会因为体积过大受到包埋框的挤压而使得组织变形。在切取组织的时候，首先应当保证所取的组织是完整的，并尽可能将组织切得平整，尽量防止病理组织的弯曲扭转，否则切片的时候，呈现出的组织切面会有断裂，并且在包埋的时候，石蜡也不易渗透入断裂孔隙中，切片的时候，会产生因组织受力不均而发生石蜡内组织破碎的现象，这些都会影响实验结果。
三、固定
在组织取材完用大头针连同标记的纸片一起串好放入甲醛固定液的时候，标记的纸片不宜与组织靠得太近。在把组织放在包埋框准备脱水的时候，常有纸片粘附在组织上。当时将纸片取下后，发现还会有残余的纸片贴在组织上，这对之后的切片是会有影响的。而标本最好悬浮于固定液之中，漂浮于固定液之上或沉于烧杯的底部，否则当标本量大的时候，可能会减少标本与固定液的接触面，这样不利于固定液对标本的渗入。
四、脱水
脱水机应该提前打开电源预热，应该和病理室的老师事先沟通好，或者在脱水机上放张纸条，注明姓名以及需要使用脱水机的时间，这样可避免其他人在不知情下关了机器而影响实验进度。脱水前后，都应该按照脱水机的使用说明流程操作。脱水完毕要记得清洗脱水机，方便他人使用。应当提前一天预热包埋机，放入足够量的石蜡，保证包埋的时候不会出现石蜡短缺。
五、石蜡包埋
脱水完毕后，取出准备好包埋框。组织和标记的纸片一一对应，按序排列。组织排放的时候，切面应该向下，并且保证切面是组织的最大面。这样一来可防止因切面过小而造成显微镜观察时视野过小，二来也可避免因切面过小而遗漏了某些病变组织。
搭铜框的时候，要注意手套上粘附的石蜡在遇冷结块后不要掉进铜框内，这样可保证蜡块底部的平整。镊取组织块放入包埋框石蜡内动作应迅速。包埋用的镊子最好有两把可以交替使用，并且应该插在包埋机上加温，防止镊子粘蜡。切面朝下放正置入框底，尽可能使组织放平，在不损伤组织的情况下可用镊子轻压，保证不有气泡。组织应当放置于石蜡块的正中央，这样不仅可保持以后的切片美观，同时也能保证蜡块在切片过程中，其中固定的组织受力均匀。
待石蜡表面凝固前将标签贴于其上，此时需注意勿使标签与标本混淆。做标记的纸片不宜过大，否则容易因为粘附蜡块不佳而掉落。制片上用铅笔标记应当清晰，否则时间长了，会增加辨认蜡块的难度，这样对于以后的制片及病理观察会带来不必要的麻烦。
六、切片
切片是病理制片重要的一个步骤，一张良好的片子不仅取决于制片人对切片机性能的熟练掌握，更需要长期大量的实践经验的积累。
（一）、切片前的准备：
1、恒温水浴锅：恒温水浴锅应放置一层保鲜膜，这样可以尽可能地减少组织中的油黏附在水浴锅锅壁上。水浴锅应首先预热至40℃。
2、切片刀：刀一定要十分锋利，多次实践发现切片刀是造成切片不良的很大原因。只有刀口无损，才能切制完整切片。在既往切片中发现，切片刀不够锋利，切片时会自行卷起或皱起，或将组织划伤出现刀痕，更不能顺利地将切片切成连续的长条带状。切片刀哪怕有细小的缺口存在，也会使制成的切片断裂、破碎，不完整，因此在将切片刀装入切片刀夹钳内之前，应当检查下刀片的是否完好。在将锋利的刀片装入切片刀槽后，调整角度和位置后随即紧固。
3、蜡块固定：检查蜡块固定后的切面位置，在切片中发现切面与刀面呈大致20°角的时候，切出的切片较平整。切面与刀面所呈角度太大，为切到最大面会较浪费组织。
4、蜡块整修：切片的时候发现，有些陈旧的蜡块组织周围的石蜡已被修去，这样修整过的蜡块切片不容易皱褶，切片即呈带状，也很少发生弯曲。这样蜡块与切片刀的接触面大大减少，又能减少切片刀的耗损。因此以后切片可以尝试将组织块左右两侧的石蜡在不损伤组织及影响诊断的原则上，予以切除。并且修切蜡块时只能一点一点地切掉蜡边，要是大片修切易使蜡块断裂露出组织。
5、载玻片：载玻片应干净，无油腻和不透明现象。有一次使用的载玻片不太干净，在贴片时，切片不易贴附在载玻片上。
（二）切片
既往多次切片，曾出现过很多问题：
1、切片纵裂：经过观察发现，主要是刀刃有损或者刀刃上粘附有细小的石蜡屑造成的。更换到刀片的其他部位进行切片或者用刷子把刀刃上的石蜡屑刷掉可以减轻切片的纵裂程度。
2、切片弯曲或卷滚：主要是刀刃钝的时候发生，有一次是因为刀刃与蜡块切面所呈的角度过大造成的。经过调整刀片切片的部位以及蜡块切面的角度之后，切片弯曲或卷滚的现象消失。
3、切片时组织破碎：这样的情况出现过几次，但每次分析下来原因都不同。主要有以下几点：
（1）刀钝。更换刀切片的部位后，问题解决了。
（2）天热，蜡块有点软。后来放在4℃冰箱中冷冻了一下，问题解决了。
（3）标本快切完的时候，组织较薄，切片时受力不均，在蜡块中破裂了。
（4）蜡块中的组织有未浸透到蜡的地方，可能是取材的时候，组织有破裂的地方，包埋的时候蜡没有渗透入破裂处的孔隙间。当切片的时候，组织受力不均，因挤压而破裂。
（5）切片的时候，没有做到匀速切片，使得组织受力不均而挤压产生破裂。
4、切片连续呈带，但是呈弧形弯曲：主要是蜡块的上下边缘区不平行并与刀刃不平行，这与切面与刀面的角度有关，尤其是已切片过的蜡块，发生的概率更大。调整蜡块切面的角度之后，问题可以缓解。
5、切片出现抓痕：主要是刀刃上有异物或者刀口上出现细缺口时候会发生这样的情况，及时用刷子刷净刀口以及更换刀片切片部位后，抓痕变浅了。
6、间歇出片：有一次，调整蜡块的固定位置后，忘了旋紧螺丝后出现了这样的现象，重新固定刀片、蜡块，并旋紧螺丝后，问题解决了。
7、切片贴在蜡块上：当刀钝的时候，这样的情况常发生。刷净刀口，选择锋利处切片后，这样的情况不再发生了。
8、切片贴于刀口：刀钝的时候，或者刀的同一部位切片次数较多后，易粘附较多的石蜡，易造成切片贴附于刀口。这样的事情经常碰到，选择锋利处切片后，切片可以顺畅切出了。
综上所述，在切片时候，遇到最多的问题还是刀钝或刀刃受损。因此，在切片时，应当时常观察刀片的锋利情况，遇到刀钝或者刀刃出现缺口的时候，一定要立即更换锋利处切片。切片时更应时时用刷子顺着刀面方向刷净刀口。在每次更换蜡块时，应习惯地检查一下组织块是否夹紧，切片刀是否稳固，稍有疏忽就会影响切片质量。在摇动切片机时，用力要均匀一致，不宜过重过猛，否则，会影响切片的质量。最后还有很重要的一点，不切片时候，要习惯性地锁住操作杆，谨防有手指被切片刀切伤。
七、展片
切下的切片带，一端用镊子轻轻拉起，应尽可能将切片带拉直展开，这样可以减少皱褶。用毛笔将切片带从刀口向上挑起，拉下切片带，然后轻拖铺于恒温水面上。水面上尽量保持无油，若发现漂浮的油过多的话需要更换水，水面油过多不利于切片的展开。在水浴锅展片时，要用力均衡，防止蜡膜上出死折。有皱褶时用镊子细心地逐个轻轻拨开，注意不可拨破组织。然后分开每张切片，选取其中最完整的，没有皱褶的切片。一般选取连续切片带中第三个切片以后的切片贴片。一般前几个切片会较厚，不利于观察。
八、捞片
捞切片的时候，载玻片的毛面应该向上。尽可能不要将切片置于载玻片的边缘，这样可防止片子在插入片槽的时候片槽边缘对标本的划伤。并且切片也不应置于靠近载玻片毛面的地方，防止染色的时候，因为染色缸内试剂量的不足而使得组织染不到。
九、烤片
讲切片放置于烤片机之前应该分清片子的正反面，以免将正面贴近烤片机，将组织烤焦。切片置于60 ℃温烤片机上，烤片40分钟。烤片温度过高，时间过长，都会引起细胞收缩，引起裂片；反之则容易掉片。
十、染色
3、染色缸内的液体使用时间及次数过多，有的缸内会有以前实验脱片留下的残余物悬浮在试剂中。应当定时更换染色缸内的试剂，以免污染了切片。
4、染色后的组织切片，要将组织四周的污染物痕迹擦掉，以免影响美观。
十、封片
1、中性树胶滴加要适量，过稠时树胶不易分开，盖玻片周边容易溢出粘住周围的物体。
2、盖玻片宜轻拿轻放，以免气泡产生影响镜检。在盖片之前要检查盖玻片是否干净，有一次封片的时候选用的盖玻片上沾有细小的粉尘，这样会影响切片的镜检。盖玻片大小选择要合适，一般要大于组织块，以防封盖不全。盖玻片要放正。
3、载玻片上编号清楚，一则美观，二则方便以后查阅片子。
总结
一张优质的切片，应当是组织固定适当，并且染色清晰，镜下胞浆与细胞核红蓝对比鲜明，更应具备：薄、平整，无皱褶压缩，无裂损抓迹及擦痕，同时贴片排列密集，整齐位置适当，透明度好，封片用胶适量，盖玻片端正，无气泡等。病理制片一环套一环，任何一个环节不按规范去操作，最终都会影响染片的质量。第一步取材组织不好，就会影响到后面的各个环节。脱水不好，则包埋后的组织块硬度不够，易出现凹陷，切不出完整的片子，有缺损的片子必然影响诊断。烤片时间过短，容易掉片；时间过长，则可能出现裂片。苏木素和伊红着色不尽意，盐酸酒精分化不良，这些都会影响最终的镜检。制作出优质的病理切片，不仅需要严谨的工作态度，更需要严格操作规范。遇到问题要善于思考，应当虚心向师兄师姐请教，互相交流，结合自己的工作环境和实际工作条件，还要善于总结、摸索，形成一套属于自己的好经验好方法。实验工作的每一方面都需熟练的技巧，这些都是需要依靠实践才能获得的。
